Transfeksi adalah introduksi DNA asing kedalam nukleur sel eukariotik. Sel yang telah digabungkan dengan DNA asing disebut transfectants. Terdapat 2 penggolongan transfectants yaitu Stable transfectants (sel yang memiliki gabungan DNA asing pada genomnya) dan Transient transfectants (DNA asing tidak terintegrasi kedalam genom, namun gen tersebut diekspresikan pada waktu yang terbatas : 24-96 jam)(Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Lebih dari 10 tahun terakhir tekhnik bioteknologi telah berkembang salah satunya untuk memasukkan makromolekul seperti DNA, RNA, oligonukleotida, protein dan molekul kecil ke sel eukariotik. Prosedur ini digunakan untuk mempelajari mekanisme ekspresi gen dan pengaturanyya, serta dalam pengembangan terapi gen untuk penyakit bawaan, kanker dan infeksi virus seperti AIDS. Ketika asam nukleat contohnya DNA yang mengkode protein ditransfer edalam nucleus sel target, maka DNA tersebut dapat digunakan sebagai cetakan sintesis mRNA yang dapat memproduksi protein terapeutik yang hilang maupun mengalami mutasi pada sel pasien.prinsip dasar transfer gen ini dapat diaplikasikan dalam praktek penelitian dengan mengkombinasi (atau memasukkan) sebuah gen bersama molekul pembawa (atau vector) yang dapat memfasilitasi DNA untuk dipindahkan secara aman dan efisien kedalam nucleus sel target. Teknik transfeksi yang umumnya digunakan dapat dibedakan menjadi 3 kelompok yaitu (1) metode yang menggunakan virus, (2) metode kimia dan (3) metode fisikal. (Lonza Cologne GmbH, 2012; Mitrović, 2003). Pada pembahasan berikut ini akan dibahas metode transfeksi non-viral pada sel hewan dan manusia
Agen transfer non-viral memiliki beberapa kelebihan dibandingkan virus rekombinan, salah satunya adalah tidak infeksius, relative non-imunogenik, memiliki toksisitas akut yang rendah, dapat mengakomodasi plasmid DNA berukuran besar dan dapat diproduksi secara sederhana pada skala besar. Namun kekurangannya adalah efisiensi transfer gen yang lebih rendah dibandingkan dengan mediasi virus, serta ekspresi gen yang sementara. (Mitrović, 2003; Tomizawa, 2013)
Gambar 1. Metode Transfeksi (Lonza Cologne GmbH, 2012)
1. METODE FISIK
Metode transfeksi secara fisik dapat mentransfer langsung asam nukleat ke dalam sitoplasma atau nucleus tanpa menggunakan substansi asing seperti lipid(Lonza Cologne GmbH, 2012)
Gambar 2. Metode Fisik Transfer Gen(Das et al., 2015)
A. Electroporation / Electro-permeabilization
Elektroforasi merupakan metode transfer gen yang sering digunakan. Prinsip kerjanya adaah sebagai berikut: (Lonza Cologne GmbH, 2012)
Ø Sel dan DNA disuspensi pada buffer elektroporasi
Ø Arus listrik dengan tegangan tinggi dialirkan ke sel
Ø Aliran listrik ini membentuk perbedaan potensial membrane dan muatan pada komponen membrane, hal ini menginduksi pori-pori pada membrane sel terbuka sementara dan DNA dapat memasuki sel.
Gambar 3. Metode electroporation (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Metode ini dapat digunakan untuk mentransfer DNA dengan fragmen yang panjang dan efisiensinya pada cell lines cukup baik. Tidak seperti reagen liposomal, metode ini tidak menginduksi sitotoksisitas pada sel. Namun metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rendahnya efisiensi pada sel primer dan tingginya mortalitas dikarenakan tingginya arus listrik atau hanya sebagian perbaikan membrane yang terjadi dengan sempurna. (Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)
B. Microinjection
Metode fisik ini terutama digunakan untuk manipulasi sel tunggal, seperti oosit dengan menginjeksi DNA, mRNA dan protein. Metode ini juga dapat digunakan untuk transfer DNA kedalam sel punca embrionik untuk membentuk organisme transgenic. Prinsip kerjanya adalah Menggunakan micromanipulator dan mikroskop, tipped pipet yang sangat halus diinsersikan kedalam sitoplasma atau secara langsung kedalam nucleus. (Lonza Cologne GmbH, 2012)
Keuntungan utama metode ini adalah efisiensi yang tinggi (mendekati 100%). Namun metode ini tidak cocok digunakan untuk transfeksi sejumlah besar sel dan metode ini memerlukan keahlian tertentu dari operator, membutuhkan waktu yang sangat lama dan biaya yang mahal.(Lonza Cologne GmbH, 2012)
Gambar 4. Metode mikroinjeksi(Ruedel and Bosserhoff, 2012)
C. Biolistic Particle Delivery System
Metode ini telah sukses mentransfer asam nukleat kedalam sel kultur dan juga sel secara in vivo. Metode ini terutama digunakan untuk vaksinasi genetic dan aplikasi agricultural dimana sel permukaan pada seluruh organ dapat ditransfeksi. Prinsip kerja metode ini adalah sebagai berikut: (Lonza Cologne GmbH, 2012)
Ø Transfer DNA yang telah dilapisi permukaannya menggunakan mikropartikel seperti emas atau tungsten
Ø Partikel diakselerasi oleh particular driving force seperti dengan meningkatkan muatan bertegangan tinggi diantara 2 elektroda atau dengan tekanan gas
Tekhnik ini cepat dan sederhana, dan memungkinkan transfeksi pada sel yang sedang membelah maupun tidak membelah. Pada metode ini juga tidak terdapat batasan ukuran atau jumlah gen yang dapat ditransfeksikan. Namun mortalitas sel sangat tinggi, maka dari itu diperlukan jumlah sel yang besar pada metode ini.(Lonza Cologne GmbH, 2012)
Gambar 5. Metode Biolistic. Langkah 1: presipitasi DNA kedalam nanopartikel emas. Langkah 2: Masukkan campuran kedalam tabung. Langkah 3:putar tabung untuk menyelubungi DNA-gold ke seluruh permukaan. Langkah 4: cut tabung menjadi cartridge. Langkah 5:load cartridge ke dalam gene gun. Langkah 6: masukkan DNA ke dalam sel target (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
D. Sonoporation
Frekuensi rendah iradiasi ultrasound menyebabkan gangguan mekanik pada membrane sel, sehingga memudahkan ambilan molekul besar disekitar gelembung kavitasi. Kolapsnya gelembung ini mengakibatkan terbentuknya lubang sementara pada membrane sel dan menginduksi permeabilisasi membrane yang bersifat sementara. Pembentukan porus kecil pada membrane sel oleh adanya gelombang ultrasound ini dapat mempermudah transfer DNA/RNA kedalam sel, teknik ini disebut dengan metode Sonoporation.(Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)
Sonoporasi ini memiliki beberapa kelemahan, diantaranya adalah rendahnya efisiensi transfer gen. untuk pengaplikasian sonoporasi secara in vivo pada seekor tikus diperlukan sekitar 37,5-50µg plasmid. Keterbatasan lainnya adalah kerusakan sel, akibat iradiasi sel dengan 2,25 MHz yang terus menerus selama 1 menit, terjadinya aktivitas enzimatik dan perubahan membrane mitokondria serta stress retikulum endoplasma dapat menginduksi apoptosis sel. (Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)
. 
Gambar 6. Terbentuknya porus setelah paparan ultrasound(Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)
E. Optical Transfection
Metode transfeksi optic merupakan metode yang menggunakan cahaya laser untuk secara sementara membuat sejumlah sel menjadi permeable dalam waktu yang sangat singkat. Beberapa substansi dapat diinjeksikan ke beberapa jenis sel dengan metode ini secara efisien, contohnya adalah ion, molekul keci, dextran, short interfering RNAs (siRNAs), plasmid, protein dan nanokristal semikonduktor. Keuntungan menggunakan system ini adalah metode ini sangat efisien dan bekerja pada banyak jenis sel, serta memerlukan manipulasi sel yang sangat sedikit. Kerugiannya adalah, metode ini memerlukan sel untuk ditempeli dan memerlukan peralatan yang mahal. (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Gambar 7. Metode Optical Transfection (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
F. Magnetofection
Metode transfeksi dengan mediasi magnet merupakan metode dengan menggunakan kekuatan magnet untuk menghantarkan DNA kedalam sel target. Asam nukleat pertama dicampurkan dengan nanopartikel magnetic, kemudian ditambahkan kekuatan magnet ke solusi kompleks asam nukleat-partikel menuju sel target dimana asam nukleat dilepaskan.(Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Gambar 8. Metode Magnetofection. Langkah kerja : dilusikan asam nukleat didalam medium, tambahkan nanopartikel magnetic, kemudian inkubasi selama 10-20 menit. Tambahkan medium pada sel yang menempel (2-4x105sel). Tambahkan larutan asam nukleat dan nanopartikel magnetic, kemudian tempatkan pada plate magnetic, inkubasi selama 15 menit. (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Keuntungan menggunakan metode ini adalah pengerjaan yang cepat, peningkatan efisiensi transfeksi dengan transport langsung khususnya pada jumlah asam nukleat yang kecil, rata-rata transfeksi tinggi pada cell line mamalia adherent, dan membutuhkan perawatan sel yang minimal.(Ruedel and Bosserhoff, 2012)
2. METODE KIMIA
Metode kimiawi merupakan teknik transfeksi menggunakan molekul pembawa untuk menembus barrier membrane sel, namun tidak terdapat reaksi kimia antara molekul pembawa dan asam nukleat maupun komponen selular lainnya. Prinsip metode ini adalah adanya interaksi asam nukleat dengan muatan negative dan molekul pembawa yang bermuatan positif., seperti polymer atau lipid, yang mempermudah asam nukleat untuk berkontak dengan komponen membrane yang bermuatan negative, dan kemudian menyatu kedalam sel melalui endositosis dan akhirnya dilepas ke dalam sitoplasma. (Lonza Cologne GmbH, 2012)
A. DEAE-Dextran Transfection
Gambar 9. Struktur DEAE-dextran(Ruedel and Bosserhoff, 2012)
DEAE-dextran merupakan metode transfeksi non-virus pertama yang ditemukan oleh Vaheri dan Pagano pada tahun 1965. Prinsip metode ini adalah sebagai berikut :(Lonza Cologne GmbH, 2012; Mitrović, 2003)
Ø DNA dicampurkan dengan DEAE- dextran, polybrene, polyethylenimine and dendrimer (polycationic turunan dextran, sebuah polimer karbohidrat) membentuk kompleks disebut polyplex
Ø Kompleks DNA/polimer kemudian berkontak dengan membrane bermuatan negative dikarenakan muatan positif yang dibawa oleh polimer.
Ø Kompleks DNA/polimer kemudian diendositosis
Gambar 10. Metode DEAE-Dextran. Solution A: DNA (~1–5 µg/ml) didilusi kedalam 2 ml growth medium dengan serum mengandung klorokuin. Solution B: larutan DEAE-dextran
(~50–500 µg/ml). Solution C: Larutan
~5 ml of DMSO. Solution D: Complete growth medium. Langkah 1: campurkan
Sol A dan B. Langkah 2:aspirasi medium sel kultur, kemudian tambahkan campuran
Sol A dan B, inkubasi selama 4 jam. Langkah 3:aspirasi supernatant. Langkah 4:
tambahkan solution C untuk induksi uptake DNA. Langkah 5: buang DMSO dang
anti dengan Solution D, lakukan
penilaian ekspresi gen . (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Keuntungan menggunakan metode transfeksi DEAE-dextran adalah metode ini cukup sederhana dan murah. Namun efisiensi cukup rendah pada berbagai tipe sel, dan harus diperhatikan efek toksisitasnya. (Lonza Cologne GmbH, 2012)
B. Calcium Phosphate Co-Precipitation
Metode transfeksi ini telah dilakukan oleh Graham dan Van pada tahun 1973. Prinsip pada metode ini adalah : (Lonza Cologne GmbH, 2012)
Ø DNA dicampurkan dengan Calcium Chloride
Ø Tambahkan buffer saline/larutan phosphate dan inkubasi pada suhu ruangan
Ø Formasi DNA- calcium phosphate coprecipitates menempel pada permukaan sel kemudian diendositosis
Gambar 11. Metode Transfeksi dengan Calcium Phosphate. Solution
A: DNA pada larutan Kalsium. Solution B: 2x
Hanks buffered saline solution. Langkah
1:tambahkan Solution A dan B sambal
di Vortex. Langakh 2: inkubasi 20-30
menit, tambahkan ke sel kultur. Langkah 3: inkubasi 2-12 jam, ganti solution dengan complete
growth medium. Langkah 4: penilaian transient dan stable transfectant. (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Metode ini cukup luas digunakan karena komponennya mudah didapatkan. Selain itu keuntungannya adalah dapat diaplikasikan untuk transfeksi pada sel line, dapat digunakan untuk penelitian ekspresi gen dalam jangka waktu yang lama. Kelemahan dari metode ini mencakup toksisitasnya khususnya pada sel primer dan sensitivitasnya pada perubahan pH, suhu dan konsentrasi garam buffer, juga memiliki efisiensi yang rendah jika dibandingkan dengan metode kimiawi lainnya seperti lipofection. (Lonza Cologne GmbH, 2012)
C. Liposome Encapsulation (Lipofection)
Lipofection merupakan metode transfer gen yang umum digunakan. Terdapat 3 generasi diantara reagen lipofection, generasi pertama yaitu reagen liposomal kationik yang terdiri dari muatan positif seperti amine, ester atau ether dan grup 2 atau lebih . Generasi kedua yaitu reagen liposomal multikomponen yang terdiri dari lipid, polimer dan kombinasinya. Dan generasi ketiga terdiri dari reagen liposomal multikomponen yang berkonjugasi dengan antibody atau ligand yang memiliki target spesifik. (Lonza Cologne GmbH, 2012)
Prinsip kerja metode ini yaitu :(Lonza Cologne GmbH, 2012; Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Ø Lipid kationik dicampur dengan lipid netral/ helper lipid (contohnya DOPE), terbentuk unilamelar vesikel liposom yang membawa muatan positif
Ø Asam nukleat diserap kedalam vesikel ini
Ø Absorbs ionic ke membrane selular
Ø Uptake struktur ini secara endositosis
Ø Helper lipid seperti DOPE membantu DNA lolos dari endosome dengan adanya fusi liposom dan membrane
Gambar 12. Metode Transfeksi : Liposomal/lipofection (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
Keuntungan utama dari reagen transfeksi lipid ini adalah kemampuannya untuk mentransfeksi pada banyak variasi tipe sel (terutama adherent cell line ) dengan efisiensi tinggi serta harga yang cukup murah. Keuntungan lainnya adalah dapat membawa DNA dalam berbagai ukuran, RNA dan protein baik untuk transient maupun untuk produksi protein. Namun terdapat beberapa kekurangan pula pada metode ini, seperti rendahnya efisiensi pada sebagian besar cell line yang berbentuk suspense, yang dihubungkan dengan aktivitas endositosisnya, toksisitas dan terkait pada pembelahan sel.(Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)
Generasi kedua menggunakan lipid non-liposomal dan polymer yang bergabung bersama DNA atau RNA dan membentuk mecelles. Reaksi ini seringkali dilakukan dalam kondisi aqueous. Dendrimers merupakan makromolekul globular 3 Dimensi yang mampu memadatkan DNA dalam kompleks kecil, dan meningkatkan efisiensi transfeksi plasmid. Dendrimers stabil pada aserum dan tidak sensitive terhadap suhu, sehingga memiliki efisiensi transfeksi yang tinggi pada beberapa model kultur jaringan. Namun begitu, dendrimer juga non-biodegradable dan dapat menyebabkan sitotoksisitas yang signifikan. (Lonza Cologne GmbH, 2012)
Gambar 13. Overview metode lipofection (Ruedel and Bosserhoff, 2012)
DAFTAR PUSTAKA
Das, A.K., Gupta, P., Chakraborty, D., 2015. Physical methods of gene transfer: Kinetics of gene delivery into cells: A Review. Agric. Rev. 36, 61. https://doi.org/10.5958/0976-0741.2015.00007.0
Lonza Cologne GmbH, 2012. An Introduction to Transfection Methods. Infection 49, 395–401. https://doi.org/10.3791/5068
Mitrović, T., 2003. Gene Transfer Systems. Med. Biol. 10, 101–105.
Ruedel, A., Bosserhoff, A.K., 2012. Transfection Methods. Methods Cell Biol. 112, 163–182. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405914-6.00008-1
Tomizawa, M., 2013. Sonoporation: Gene transfer using ultrasound. World J. Methodol. 3, 39. https://doi.org/10.5662/wjm.v3.i4.39
