Pada praktek klinik, saat ini penggunaan analisis protein multipleks sudah sangat berkembang terutama pada sampel plasma darah atau serum. Analisis ini terutama digunakan dalam diagnosis klinis, validasi biomarker, pengukuran pada tingginya perubahan kadar protein dan pengukuran jalur fisiologis dan status penyakit. (Christiansson et al., 2014; Kingsmore, 2007) Kuantifikasi protein multipleks memerlukan spesifisitas reagen detektor yang sangat tinggi, begitu pula dengan buffer maupun reagen lainnya yang digunakan. Vignali telah mendefinisikan tujuh parameter utama untuk menciptakan pengukuran multipleks yang optimal, yaitu spesifisitas, sensitifitas, simplisitas, reliabilitas, kemampuan multipleks, biaya dan waktu. (Christiansson et al., 2014) Terdapat dua tipe tekhnologi analisis multipleks yang sering digunakan, yaitu menggunakan mass spectrometry dan protein arrays. (Kingsmore, 2007)
A. Mass spectrometry
Spektrometri massa umumnya digunakan untuk survei proteomik secara komprehensif yang bertujuan sebagai alat explorasi awal untuk membuat hipotesis. Pada umumnya, metode ini mencakup identifikasi sekelompok protein pada level ekspresi yang berbeda-beda. Spesifikasi teknologi survei komprehensif kadar protein dapat digunakan pada berbagai sampel contohnya adalah lysate jaringan, pada volume sampel kecil hingga 100 sampel dan dengan biaya yang tidak terlalu tinggi. (Kingsmore, 2007)
Metode ini ideal untuk inisiasi survei proteomik yang cepat dan cost-effective pada sistem eksperimental. Namun begitu, metode ini memiliki keterbatasan, pertama yaitu sensitivitas yang lebih rendah dari ELISA, dan keterbatasan penggunaan teknologi pada protein yang kecil atau sedikit, seperti sitokin pada sampel darah. Namun sensitivitas pada metode ini dapat ditingkatkan dengan menghilangkan protein lain yang memiliki konsentrasi tinggi, misalnya albumin dan immunoglobulin pada sampel plasma. Kedua, persiapan sampel harus benar-benar diperhatikan, khususnya untuk protein-protein intraselular atau protein terkait membran. Penyimpanan sampel juga harus diperhatikan karena protein bersifat labil dan degradasi selama preparasi sampel atau penyimpanan dapat mengganggu identifikasi protein. Ketiga, identifikasi protein automatis menggunakan database seringkali dikacaukan dengan hasil positif palsu (dikarenakan pengukuran yang tidak akurat dalam rasio m/z, pemotongan peptide tidak spesifik, atau entri database yang tidak komplit atau tidak akurat) dan hasil negatif palsu (dikarenakan fragmen peptida dari protein kecil). Keempat, spektrometri massa merupakan alat pemeriksaan semikuantitatif dan paling baik digunakan untuk identifikasi ekspresi dengan perbedaan yang besar (lebih dari 5 fold). Untuk semua alasan inilah, pengukuran protein multipleks dengan spektrometri massa sangat baik digunakan untuk membangun hipotesis, daripada untuk uji hipotesis, maupun eksperimen.(Kingsmore, 2007)
Gambar 1. Mass Spectrometry (Cañas Montalvo et al., 2006)
B. Protein arrays
Platform immunoassay konvensional memiliki keterbatasan kapasitas multipleks dan memerlukan volume sampel yang besar. Pengukuran immunoassay multipleks high-throughput diawali oleh Ward, Schreiber, Synder dan Brown, yang dapat mengukur ratusan protein dalam matriks kompleks biologis dan menjadi alat pengukuran kuantitatif dalam studi proteomic, diagnostik dan pengembangan obat berdasarkan biomarker.(Kingsmore, 2007)
Terdapat tiga kategori antibody microarray yaitu,(1) penandaan langsung, single-capture antibody, (2) dual antibody (capture dan read-out antibody), sandwich immunoassay, (3) antigen atau protein-capture arrays, dengan antibody read-out tunggal. Pada metode penandaan (labelling) langsung, semua protein pada sampel menjadi target, untuk deteksi protein yang berikatan diikuti dengan inkubasi pada antibody microarray. Pada metode sandwich immunoassay, protein ditangkap pada antibody microarray yang terdeteksi menggunakan antibodi detektor yang ditandai, dimana setiap antibody memiliki kecocokan pada satu dari antibody microarray. Pada antigen-capture arrays, antigen dicetak pada array dan ligan pada sampel eksperimental dideteksi pada basis dari pengikatan read-out antibody yang ditandai. (Kingsmore, 2007)
Berbagai substrat microarray yaitu membran nilon, microwells plastik, planar glass slides, gel-based arrays dan beads pada suspension arrays. Sementara itu berbagai strategi signaling pada metode ini telah banyak dikembangkan, termasuk colorimetry, radioactivity, fluorescence, chemiluminescence, quantum dots, nanopartikel, enzyme-linked assays, resonance light scattering, tyramide signal amplification, rolling circle amplification dan eTag protein proximity assays. Masing-masing prosedur dan metode ini memiliki kelebihan dan kekurangan yang sebagian besar berkaitan dengan sensitifitas, spesifisitas, dinamis, kemampuan multipleks, presisi, dan kemudahan dalam penggunaan. Umumnya metode microarray memerlukan sampel dan reagen yang sedikit (pikoliter sampai microliter), hal ini juga menyebabkan pengurangan waktu reaksi karena jarak difusi semakin pendek.(Kingsmore, 2007)
Terdapat beberapa contoh metode analisis protein multipleks, diantaranya adalah BioPlex, Meso Scale Discovery and Myriad RBM. Ketiga platform multipleks ini digunakan untuk pengukuran kuantitatif terhadap protein, dengan prinsip dasar yang sama dengan ELISA, yaitu immunoassay yang menganalisis antigen diantara 2 antibodi (capture- dan detection). Pada tekhnik ELISA, antibodi dideteksi dengan adanya konjugasi bersama enzim, kemudian setelah ditambahkan substrat maka akan terjadi reaksi katalisasi sehingga terjadi pembentukan warna pada microtiter plate. Intensitas warna yang terbentuk kemudian diukur menggunakan spektrofotometri dan berhubungan dengan jumlah protein spesifik yang dideteksi pada sampel. Metode lainnya, dikembangkan oleh Meso Scale Discovery, yang mengaplikasikan electrochemiluminescence untuk mengkuantifikasi protein pada microtiter plate. Metode ini dapat mentarget protein berbeda karena dapat menangkap antibodi spesifik terhadap target berbeda yang ditempatkan pada dasar microtiter plate. Metode ini memiliki kits yang dapat digunakan untuk menganalisis hingga 10 protein berbeda. (Christiansson et al., 2014)
Pada teknologi microsphere-based yang dikembangkan oleh Luminex Corporation, bagian Fc dari capture antibody terikat pada grup fluorescent microspheres. Setiap grup memiliki sedikit perbedaan intensitas fluoresens dan ditutup oleh antibody yang mengenali protein tertentu. Terdapat 2 sistem dengan metode Luminex ini, yaitu Myriad RBM (flow-based) yang dapat menganalisa hingga 500 protein dan BioPlex (menggunakan sistem magnetic fluorescent beads) yang dapat menganalisa hingga 50 protein.(Christiansson et al., 2014)
Gambar 2. Contoh Aplikasi Microarrays pada proteomic. (A) anotasi protein fungsional dengan mengintegrasikan antibodi dan probe. (B) Substrate fingerprinting domain SH3 dengan mengintegrasikan metode komputasional dan array peptide(Sun et al., 2013)
C. Antibody barcoding with photocleavable DNA (ABCD) platform
Pada metode ini, antibody di-barcode dengan DNA photocleavable (ABCD) untuk melakukan pengukuran protein secara multipleks dan profiling pada sejumlah kecil protein di sampel klinik (~100 cells). Penanda pada metode ini adalah DNA (70mer) yang akan menandai antibodi dengan sekuens tertentu. Setelah antibodi berikatan dengan sel, photocleavable linker kemudian melepaskan barcode DNA unik yang kemudian dapat dideteksi. (Ullal et al., 2014)
Gambar 3. Multipleks platform ABCD pada sel tunggal(Ullal et al., 2014)
DAFTAR PUSTAKA
Cañas Montalvo, B., López-Ferrer, D., Ramos-Fernández, A., Camafeita, E., Calvo, E., 2006. Mass spectrometry technologies for proteomics. Briefings Funct. Genomics Proteomics 4, 295–320. https://doi.org/10.1093/bfgp/eli002
Christiansson, L., Mustjoki, S., Simonsson, B., Olsson-Strömberg, U., Loskog, A.S.I., Mangsbo, S.M., 2014. The use of multiplex platforms for absolute and relative protein quantification of clinical material. EuPA Open Proteomics. https://doi.org/10.1016/j.euprot.2014.02.002
Kingsmore, S.F., 2007. of Protein and Antibody Arrays. Genome 5, 310–320.
Sun, H., Chen, G.Y.J., Yao, S.Q., 2013. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem. Biol. 20, 685–699. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2013.04.009
Ullal, A. V., Peterson, V., Agasti, S.S., Tuang, S., Juric, D., Castro, C.M., Weissleder, R., 2014. Cancer cell profiling by barcoding allows multiplexed protein analysis in fine-needle aspirates. Sci. Transl. Med. 6. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3007361
