KULIAH- PERAN TEKHNOLOGI BIOLOGI MOLEKULAR DALAM ILMU KEDOKTERAN

BIOLOGY MOLECULAR, kepada mahasiswa Semester 2 TA 2018/2019 modul Biomol, Berikut ini materi kuliah yang akan disampaikan pada tanggal 10 April 2019

Pendekatan Forward Genetic Untuk Mendeteksi Penyakit Genetic (QTL Approach)

Biologymolecul, Pendekatan Forward Genetic Untuk Mendeteksi Penyakit Genetic (QTL Approach) - Teknologi untuk mengetahui adanya ablasi ataupun ekspresi gen tunggal yang berkaitan dengan fungsi gen tertentu dengan menggunakan knockout atau tekhnologi transgenik yang telah banyak digunakan, namun tekhnologi ini tidak dapat memaparkan adanya variasi genetik lainnya yang terjadi pada populasi hewan eksperimen. Para peneliti saat ini telah mengembangkan tekhnologi untuk menemukan variasi genetik hasil dari substitusi nukleotida tunggal, insersi, delesi, variasi copy number, perubahan epigenetik (metilasi DNA, modifikasi histon dan lainnya) dan perbedaan ekspresi gen dan bagaimana variasi ini berkontribusi pada fenotip yang lebih kompleks. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012).

Berbeda dengan reverse genetic, studi forward genetic dimulai dengan pengukuran atau observasi pada sebuah fenotip dan diikuti oleh pemetaan lokus atau gen penyebab.(Lawson and Wolfe, 2011; Tarantino and Eisener-dorman, 2012; Zakhrabekova et al., 2013) Keuntungan utama pendekatan ini adalah bahwa pengaturan gena pada proses biologis spesifiklah yang menjadi prioritas.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012) Tujuan pendekatan ini adalah untuk menentukan dasar genetik pada variasi fenotip yang diobservasi.(Lawson and Wolfe, 2011; Zakhrabekova et al., 2013) Untuk membuat mutasi acak pada organisme, berbagai cara telah digunakan seperti X-rays, radiasi ultraviolet, dan kemikal. Perusakan gen ini kemudian diikuti dengan seleksi fenotip yang tampak, dihubungkan dengan berbagai pembawa sifat seperti maturitas awal, resistensi penyakit, toleransi dingin, dan lain sebagainya.(Zakhrabekova et al., 2013) Pendekatan ini dapat diaplikasikan pada banyak pendekatan phenotype-driven mapping, salah satunya mencakup identifikasi quantitative trait loci (QTL) yaitu untuk penggunaan standard persilangan inbred strain dan analisis berkaitan dengan haplotype. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012).

Perbedaan forward genetic dan reverse genetics

QTL Approach : inbred strain

Inbred strain diproduksi dengan mengawinkan tikus yang bersaudara sebanyak 20 generasi atau lebih untuk memfiksasi semua lokus pada alel homozigot, sehingga didapatkan ratusan inbred strain dan tikus dalam inbred strain tunggal secara genetik diidentifikasi, begitu pula substansi genetik dan variasi fenotip nya. Variasi ini kemudian digunakan selama puluhan tahun untuk mempelajari lebih lanjut mengenai dasar genetik penyakit pada manusia. Baik inbred strain maupun hasil persilangan tikus ini merupakan instrument yang digunakan untuk penelitian gen dan lokus genomik yang berkontribusi dalam variabilitas fenotip untuk pembawa sifat perilaku yang kompleks. Lokus-lokus ini disebut dengan quantitative trait loci, atau QTL, yang merupakan daerah genom yang berhubungan dengan ekspresi fenotip pada pembawa sifat yang kompleks, dan lokasi genomik dari daerah ini dapat diidentifikasi menggunakan pemetaan QTL.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Pemetaan QTL dapat digambarkan sebagai analisis statistik hubungan antara fenotip dan genotip pada lokasi spesifik genom. Variasi fenotip dapat diobservasi diantara inbred strains, sedangkan variasi genetik dapat diukur menggunakan marker yang dapat membedakan diantara dua atau lebih strain pada penelitian. Marker genetik ini contohnya penggunaan restriction fragment length polymorphisms (RFLP) pada fenotip berupa warna bulu tikus. Dengan adanya perkembangan tekhnologi polymerase chain reaction (PCR), para peneliti telah dapat meneliti marker genetik yang disebut dengan simple sequence length polymorphism (SSLPs) yang dapat memetakan gen lebih banyak dan lebih padat. Single nucleotide polymorphism (SNPs) merupakan perubahan nukleotida tunggal yang juga dapat dideteksi oleh PCR, dan dapat ditemukan diantara inbred strains. SNPs merupakan sumber dari pengukuran variasi genetik pada penelitian pemetaan genetik.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Inisiasi identifikasi QTL

1.      Recombinant Inbred Lines (RI lines)

RI lines dibuat dengan cara mengawin-silangkan progenitor inbred strain F1 ke progenitor generasi F2, kemudian dikawinkan antar saudara hingga sedikitnya 20 generasi dan menghasilkan homozigositas pada setiap lokus dan campuran alel parenteral yang mengakibatkan terjadinya variasi genetika yang penting untuk pemetaan QTL.  RI lines memiliki beberapa keunggulan untuk pemetaan QTL, salah satunya RI lines merupakan polulasi referensi untuk genetika. RI lines secara genetik stabil untuk waktu yang lama dan dapat bereproduksi secara tidak terbatas. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

RI lines secara khusus cocok untuk pemetaan QTL untuk fenotip dimana terjadi variansi genetik yang kecil dibandingkan dengan variansi lingkungan. Gambaran RI lines ini didapatkan dari kemampuannya untuk mengkonduksi sampling berulang dari individu dengan latar belakang genetika yang sama, sehingga menghasilkan strain yang lebih akurat untuk merefleksikan fenotip strain tertentu. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Gambar.2. 

Skema perkawinan dari populasi untuk pemetaan genetik. (A) Backcross mice dibuat dengan mengawinkan 2 inbred strain ke mencit F1 dan kemudian dikawinkan dengan orang tuanya sehingga menghasilkan 1 cetakan kromosom yang memiliki rekombinasi meiotic dan cetakan lainnya dari inbred strain F1. (b) intercross mice dihasilkan dari menyilangkan mencit F1, sehingga menghasilkan 2 kromosom rekombinan. (c) recombinant inbred strain diproduksi dengan mengawinkan antar saudara F2 secara terus menerus, menghasilkan homozigositas pada setiap lokus tapi dengan penggabungan alel dari setiap strain orang tua. (d) advanced intercross lines juga diproduksi dengan menyilangkan F2, namun dengan memilih pasangan kawin. (e ) congenic strains memiliki porsi yang kecil dari 1 kromosom strain donor kedalam strain penerima, sementara strain kromosom substitusi (f) memiliki seluruh kromosom donor ke dalam strain penerima. (g) heterogenous stocks mirip dengan advanced intercross lines tapi didapat dari delapan inbred strain yang berbeda untuk meningkatkan diversitas genetik. (h) the collaborative cross juga memiliki delapan strain orang tua, tapi skema perkawinannya mirip dengan recombinant inbred strain untuk memaksimalkan rekombinasi.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

2. Populasi pemetaan Intercross and Backcross

Pemetaan QTL yang paling banyak digunakan adalah intercross (F2) atau Backcross (BC) yang diproduksi dengan mengawinkan 2 inbred strains yang diketahui memiliki pembawa sifat yang berbeda. Hasil progenitor hybrid F1 juga dilakukan perkawinan antar F1 untuk menghasilkan generasi F2 atau BC ke salah satu orang tua untuk menghasilkan generasi BC. Pada setiap lokus, hewan F2 memiliki salah satu dari 3 genotip yaitu homozigot alell orang tua atau heterozigot, dengan satu allel dari masing-masing strain orang tua. Sedangkan hewan BC hanya memiliki dua kemungkinan genotip yaitu heterozigot atau homozigot. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

3. Consomic Lines  atau Chromosome Substitution Strains

Galur consomic atau strain substitusi kromosom (CSS) diproduksi dengan mentransfer kromosom tunggal dari strain donor kedalam strain resipien dengan BC berulang minimal sebanyak 10 generasi. Panel lengkap CSS terdiri atas 21 lines, 1 untuk 19 kromosom dan 2 kromosom sex. CSS lines merupakan populasi referensi genetik yang digunakan untuk lokalisasi QTL atau kelompok QTL terhadap sebuah kromosom tunggal dan memiliki beberapa keuntungan dibandingkan populasi pemetaan standard lainnya. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Pemetaan yang berhubungan dengan Haplotype (Haplotype Association Mapping /HAM)

Survei inbred strain merupakan langkah inisiasi penting dalam memahami struktur genetik dan fenotipik dari pembawa sifat yang kompleks. Pada tahun 2000, the Mouse Phenome Project telah dimulai sebagai upaya untuk mengumpulkan data fenotip dari set inbred strain. Data ini bersamaan dengan upaya untuk meningkatkan jumlah identifikasi SNPs pada tikus inbred dan membuat pemetaan SNP haplotype yang mirip dengan HapMap pada manusia. Pada tahun 2001, Grupe et al menggunakan fenotip inbred strain yang telah ada dari MPD dan lebih dari 3000 SNP telah diidentifikasi di laboratorium mereka, dan di institute Whithead telah dikembangkan “in silico QTL mapping” pada tikus. Haplotype association mapping (HAM) dapat digunakan sebagai alat untuk identifikasi QTL dengan syarat dapat menerapkan 3 faktor yaitu; melingkupi kepadatan SNP pada seluruh genom pada lebih banyak strain, data fenotip pada strain multiple dan dapat menganalisis asosiasi genotip-fenotip.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Mutagenesis

Langkah awal pada pendekatan forward genetic adalah dengan membuat lesi mutagenik yang dapat diturunkan, dan dapat diperiksa efeknya pada fenotip suatu organisme. (Lawson and Wolfe, 2011) Mutagenesis yaitu menginduksi mutase dengan bahan kimia atau radiasi, salah satunya dengan penggunaan N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sebagai mutagen kimia pada mencit yang telah dimulai sejak tahun 1978. ENU merupakan agen alkylating yang menyebabkan mutasi basa tunggal, biasanya transversi A-T menjadi T-A atau transisi A-T menjadi G-C. ENU menginduksi mutasi acak yang dapat diturunkan, dank arena alasan ini ENU dapat menginduksi mutase tunggal tanpa bias yang dapat mempengaruhi fenotip yang kompleks. Analisis selanjutnya setelah mutagenesis ini adalah pemetaan mutasi penyebab dan diikuti oleh identifikasi lesi genetik. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Gambar 3. 

Mutagenesis ENU. Skema standard mutagenesis ENU mencakup penyuntikan mencit jantan (G0) dengan ENU. Dosis bervariasi tergantun galur, tapi umumnya 3 kali seminggu injeksi 85-100mg/kg untuk mencit B6. Mencit jantan yang diinjeksi ENU menjadi infertile saat diterapi tapi kemudian banyak yang kembali subur setelah 10-12 minggu. Infertilitas sering digunakan sebagai indicator bahwa ENU bekerja efektif. Setelah kembali subur, mencit tersebut dikawinkan dengan betina normal dari galur yang sama ayau galur berbeda menghasilkan mencit G1, dan dapat diperiksa mutase dominan yang terjadi. Mencit G1 mendapatkan genom mutagenesis dari ayah dan mutase ini berbeda-beda diantara G1. Untuk recoveri mutase resesif, G1 betina dikawinkan dengan ayah G1 untuk menghasilkan G2. Dua cetakan mutase dari ayah dan anak betina akan ditemukan pada G3 dengan rata-rata 1 mutasi setiap 8 G3. Untuk alasan ini, pedigree G3 sering kali diperiksa fenotipnya untuk menemukan satu atau dua hewan yang terpengaruh dan membentuk koloni fenotip mutan baru.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012). By dr. Sari Eka Pratiwi

DAFTAR PUSTAKA

Lawson, N.D., Wolfe, S.A., 2011. Perspective Forward and Reverse Genetic Approaches for the Analysis of Vertebrate Development in the Zebrafish. Dev. Cell 21, 48–64. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2011.06.007

Tarantino, L.M., Eisener-dorman, A.F., 2012. Forward Genetic Approaches to Understanding Complex Behaviors 25–58. https://doi.org/10.1007/7854

Zakhrabekova, S.M., Gough, S., Lundh, L., Hansson, M., 2013. Functional Genomics And Forward And Reverse Genetics Approaches For Identification Of Important QTLs In Plants 28, 23–28.

Nanopartikel Polimerik Sebagai Sistem Penghantar Obat

Aplikasi nanotekhnologi pada bidang kedokteran dan farmaseutikal telah mengalami perkembangan pesat pada abad ke 20 ini. Nanotekhnologi merupakan perlakuan pada suatu atom atau molekul kedalam suatu struktur untuk menghasilkan material (nanomaterial) dan alat (nanodevices) dengan fungsi khusus. Nanomaterial dapat diklasifikasikan berdasarkan dimensi menjadi : (1)nanorods, kawat berukuran nano dengan dimensi kurang dari 100nm, (2) tabung, fiber, platelet yang memiliki dimensi kurang dari 100nm dan (3) partikel, quantum dots, dengan dimensi kurang dari 100nm. Nanomaterial juga dapat dibedakan berdasarkan komposisi fasenya yaitu : (1) nanomaterial dengan fase solid tunggal, crystalline, partikel amorf, dan layers, (2) multiphase solid, dan (3) multi-phase system yang mencakup koloid, aerogel, ferro fluid dan lain sebagainya (Nikalje, 2015). Nanomaterials, yang diklasifikasikan menjadi nanocrystalline dan material dengan nanostruktur banyak digunakan dalam rekayasa jaringan, enkapsulasi obat, penggantian tulang, dan prosthesis seperti neuroprostetik, organ artifisial dan prostetik maxillofacial (Yadav et al., 2018).

 

Gambar 1. Skema nanotekhnologi (Nikalje, 2015)

Nanopartikel didefinisikan sebagai suatu partikel terdispersi atau berbentuk solid dengan ukuran 10-100nm. Obat-obatan yang akan dibawa oleh nanopartikel akan terlarut, terperangkap, dikapsulasi maupun menempel pada matriks nanopartikel. obat yang dibawa oleh nanopartikel polimerik dapat dilepaskan melalui proses desorpsi, difusi atau melalui erosi nanopartikel pada jaringan target. Terdapat berbagai jenis nanopartikel, diantaranya adalah liposom, nanopartikel polimerik, dendrimer, nanopartikel magnetik, micelle  dan nanogel seperti tampak pada gambar 2 dibawah ini (A.Z. et al., 2012; Mudshinge et al., 2011; Sirisha and D’Souza, 2017). 

Gambar 2. Gambar skematik berbagai tipe nanopartikel (Sirisha and D’Souza, 2017)

Nanopartikel polimerik merupakan suatu jenis nanopartikel yang tersusun atas polimer yang dapat didegradasi secara alami didalam tubuh. Keuntungan dalam penggunaan nanopartikel jenis ini dalam system penghantaran obat adalah (Sirisha and D’Souza, 2017):

·         Meningkatkan stabilitas dari agen farmasetika yang mudah menguap

·         Mudah dan murah dalam proses fabrikasinya tterutama untuk pembuatan dalam skala besar

·    Dapat menghantarkan obat dengan konsentrasi lebih tinggi dan pada lokasi yang spesifik (diinginkan)

 Nanopartikel polimerik terdiri dari 2 subklas yaitu nanokapsul dan nanosphere. Nanokapsul merupakan suatu sistem dimana obat dibatasi oleh membran polimerik sehingga membentuk suatu kavitas, sehingga obat akan terdispersi didalam matriks polimer. Bentuk lain dari nanopartikel polimerik adalah nanosphere, yang merupakan suatu sistem matriks, dimana matriks secara seragam terdispersi. Sebagai contoh dari nanophere ini adalah dendrimers. Dendrimer merupakan polimer yang unik, dengan makromolekul yang sangat bercabang, dengan ukuran dan bentuk yang dapat dikontrol. Dendrimer dibuat dari monomer menggunakan langkah konvergen atau divergen polimerisasi. Obat-obatan yang akan dibawa dapat diproses dengan kompleksasi maupun enkapsulasi dengan dendrimer (Sirisha and D’Souza, 2017).  

Terdapat berbagai polimer dari yang alami hingga sintetik. Polimer alami yang digunakan seperti gelatin, albumin, chitosan, DNA dan alginate memiliki kelemahan berupa mudah terdegradasi dan memiliki potensi antigenisitas. Polimer sintetik contohnya adalah polyester like polycaprolactone (PCL), poly lactic acid (PLA) atau monomer yang dapat berpolimerisasi seperti poly alkil cyanoacrylate . berdasarkan sifat nya, nanopartikel polimerik dapat dibedakan menjadi biodegradable seperti poly (L-lactide) dan poly glycolide (PGA) dan nondegradable seperti polyurethane (A.Z. et al., 2012; Sirisha and D’Souza, 2017). Nanopartikel yang mengandung polimer  biodegradable akan mengalami hidrolisis di dalam tubuh, menghasilkan monomer metabolit yang dapat didegradasi seperti asam laktat dan asam glikolat. Nanopartikel polimerik biodegradable dengan konjugasi obat digunakan untuk penghantaran obat, yang bersifat stabil didalam darah, non-toksik dan non-trombogenik (A.Z. et al., 2012; Aftab et al., 2018).

Nanopartikel polimerik seringkali dilapisi dengan surfaktan non-ionik untuk meminimalisir interaksi imunologis , sebagai contoh opsonisasi atau pengenalan nanopartikel oleh sel limfosit T-CD8. Selain itu hal ini juga untuk menghindari interaksi intermolekular pada   permukaan antar nanopartikel, misalnya daya van der was, interaksi hidrofobik atau ikatan hidrogen (A.Z. et al., 2012).

Nanopartikel polimerik saat ini telah banyak digunakan, salah satunya sebagai pembawa obat-obat antikanker. Salah satu keuntungan menggunakan nanopartikel untuk terapi antikanker ini adalah nanopartikel dapat dimodifikasi dengan ligand spesifik seperti asam folat (FA), aptamers (Apt), peptide dan antibods (Abs), sehingga dapat menujur target obat yang diinginkan. Hal ini juga bermanfaat dalam mengurangi dosis, frekuensi pemberian obat serta efek samping dari agen antikanker. Sebagai salah satu contohnya adalah penggunaan nanopartikel PLGA untuk enkapsulasi antikanker seperti paklitaksel (PTX), 9-nitrocamtothecin, cisplatin, DOX, haloperidol dan estradiol. Enkapsulasi DOX didalam PEGylated PLGA diketahui dapat meningkatkan efek anti-tumor DOX, dan menurunkan efek toksiknya dengan menekan creatinine phosphokinase (CPK) serum dibandingkan dengan DOX bebas (Aftab et al., 2018).

Pustaka

A.Z., W., K., N., K.H., M., H., C., 2012. Nanoparticles as drug delivery systems. Pharmacol. Reports 64, 1020–1037.

Aftab, S., Shah, A., Nadhman, A., Kurbanoglu, S., Ays, S., 2018. Nanomedicine : An e ff ective tool in cancer therapy 540, 132–149.

Mudshinge, S.R., Deore, A.B., Patil, S., Bhalgat, C.M., 2011. Nanoparticles: Emerging carriers for drug delivery. Saudi Pharm. J. 19, 129–141.

Nikalje, A.P., 2015. Nanotechnology and its Applications in Medicine. Med. Chem. (Los. Angeles). 5, 81–89.

Sirisha, V.L., D’Souza, J.S., 2017. Polysaccharide-Based Nanoparticles as Drug Delivery Systems 7, 1118–1122.

Yadav, H.K.S., Alsalloum, G.A., Al Halabi, N.A., 2018. Nanobionics and nanoengineered prosthetics, Nanostructures for the Engineering of Cells, Tissues and Organs: From Design to Applications. Elsevier Inc.