KULIAH- PERAN TEKHNOLOGI BIOLOGI MOLEKULAR DALAM ILMU KEDOKTERAN

BIOLOGY MOLECULAR, kepada mahasiswa Semester 2 TA 2018/2019 modul Biomol, Berikut ini materi kuliah yang akan disampaikan pada tanggal 10 April 2019

Pendekatan Forward Genetic Untuk Mendeteksi Penyakit Genetic (QTL Approach)

Biologymolecul, Pendekatan Forward Genetic Untuk Mendeteksi Penyakit Genetic (QTL Approach) - Teknologi untuk mengetahui adanya ablasi ataupun ekspresi gen tunggal yang berkaitan dengan fungsi gen tertentu dengan menggunakan knockout atau tekhnologi transgenik yang telah banyak digunakan, namun tekhnologi ini tidak dapat memaparkan adanya variasi genetik lainnya yang terjadi pada populasi hewan eksperimen. Para peneliti saat ini telah mengembangkan tekhnologi untuk menemukan variasi genetik hasil dari substitusi nukleotida tunggal, insersi, delesi, variasi copy number, perubahan epigenetik (metilasi DNA, modifikasi histon dan lainnya) dan perbedaan ekspresi gen dan bagaimana variasi ini berkontribusi pada fenotip yang lebih kompleks. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012).

Berbeda dengan reverse genetic, studi forward genetic dimulai dengan pengukuran atau observasi pada sebuah fenotip dan diikuti oleh pemetaan lokus atau gen penyebab.(Lawson and Wolfe, 2011; Tarantino and Eisener-dorman, 2012; Zakhrabekova et al., 2013) Keuntungan utama pendekatan ini adalah bahwa pengaturan gena pada proses biologis spesifiklah yang menjadi prioritas.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012) Tujuan pendekatan ini adalah untuk menentukan dasar genetik pada variasi fenotip yang diobservasi.(Lawson and Wolfe, 2011; Zakhrabekova et al., 2013) Untuk membuat mutasi acak pada organisme, berbagai cara telah digunakan seperti X-rays, radiasi ultraviolet, dan kemikal. Perusakan gen ini kemudian diikuti dengan seleksi fenotip yang tampak, dihubungkan dengan berbagai pembawa sifat seperti maturitas awal, resistensi penyakit, toleransi dingin, dan lain sebagainya.(Zakhrabekova et al., 2013) Pendekatan ini dapat diaplikasikan pada banyak pendekatan phenotype-driven mapping, salah satunya mencakup identifikasi quantitative trait loci (QTL) yaitu untuk penggunaan standard persilangan inbred strain dan analisis berkaitan dengan haplotype. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012).

Perbedaan forward genetic dan reverse genetics

QTL Approach : inbred strain

Inbred strain diproduksi dengan mengawinkan tikus yang bersaudara sebanyak 20 generasi atau lebih untuk memfiksasi semua lokus pada alel homozigot, sehingga didapatkan ratusan inbred strain dan tikus dalam inbred strain tunggal secara genetik diidentifikasi, begitu pula substansi genetik dan variasi fenotip nya. Variasi ini kemudian digunakan selama puluhan tahun untuk mempelajari lebih lanjut mengenai dasar genetik penyakit pada manusia. Baik inbred strain maupun hasil persilangan tikus ini merupakan instrument yang digunakan untuk penelitian gen dan lokus genomik yang berkontribusi dalam variabilitas fenotip untuk pembawa sifat perilaku yang kompleks. Lokus-lokus ini disebut dengan quantitative trait loci, atau QTL, yang merupakan daerah genom yang berhubungan dengan ekspresi fenotip pada pembawa sifat yang kompleks, dan lokasi genomik dari daerah ini dapat diidentifikasi menggunakan pemetaan QTL.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Pemetaan QTL dapat digambarkan sebagai analisis statistik hubungan antara fenotip dan genotip pada lokasi spesifik genom. Variasi fenotip dapat diobservasi diantara inbred strains, sedangkan variasi genetik dapat diukur menggunakan marker yang dapat membedakan diantara dua atau lebih strain pada penelitian. Marker genetik ini contohnya penggunaan restriction fragment length polymorphisms (RFLP) pada fenotip berupa warna bulu tikus. Dengan adanya perkembangan tekhnologi polymerase chain reaction (PCR), para peneliti telah dapat meneliti marker genetik yang disebut dengan simple sequence length polymorphism (SSLPs) yang dapat memetakan gen lebih banyak dan lebih padat. Single nucleotide polymorphism (SNPs) merupakan perubahan nukleotida tunggal yang juga dapat dideteksi oleh PCR, dan dapat ditemukan diantara inbred strains. SNPs merupakan sumber dari pengukuran variasi genetik pada penelitian pemetaan genetik.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Inisiasi identifikasi QTL

1.      Recombinant Inbred Lines (RI lines)

RI lines dibuat dengan cara mengawin-silangkan progenitor inbred strain F1 ke progenitor generasi F2, kemudian dikawinkan antar saudara hingga sedikitnya 20 generasi dan menghasilkan homozigositas pada setiap lokus dan campuran alel parenteral yang mengakibatkan terjadinya variasi genetika yang penting untuk pemetaan QTL.  RI lines memiliki beberapa keunggulan untuk pemetaan QTL, salah satunya RI lines merupakan polulasi referensi untuk genetika. RI lines secara genetik stabil untuk waktu yang lama dan dapat bereproduksi secara tidak terbatas. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

RI lines secara khusus cocok untuk pemetaan QTL untuk fenotip dimana terjadi variansi genetik yang kecil dibandingkan dengan variansi lingkungan. Gambaran RI lines ini didapatkan dari kemampuannya untuk mengkonduksi sampling berulang dari individu dengan latar belakang genetika yang sama, sehingga menghasilkan strain yang lebih akurat untuk merefleksikan fenotip strain tertentu. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Gambar.2. 

Skema perkawinan dari populasi untuk pemetaan genetik. (A) Backcross mice dibuat dengan mengawinkan 2 inbred strain ke mencit F1 dan kemudian dikawinkan dengan orang tuanya sehingga menghasilkan 1 cetakan kromosom yang memiliki rekombinasi meiotic dan cetakan lainnya dari inbred strain F1. (b) intercross mice dihasilkan dari menyilangkan mencit F1, sehingga menghasilkan 2 kromosom rekombinan. (c) recombinant inbred strain diproduksi dengan mengawinkan antar saudara F2 secara terus menerus, menghasilkan homozigositas pada setiap lokus tapi dengan penggabungan alel dari setiap strain orang tua. (d) advanced intercross lines juga diproduksi dengan menyilangkan F2, namun dengan memilih pasangan kawin. (e ) congenic strains memiliki porsi yang kecil dari 1 kromosom strain donor kedalam strain penerima, sementara strain kromosom substitusi (f) memiliki seluruh kromosom donor ke dalam strain penerima. (g) heterogenous stocks mirip dengan advanced intercross lines tapi didapat dari delapan inbred strain yang berbeda untuk meningkatkan diversitas genetik. (h) the collaborative cross juga memiliki delapan strain orang tua, tapi skema perkawinannya mirip dengan recombinant inbred strain untuk memaksimalkan rekombinasi.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

2. Populasi pemetaan Intercross and Backcross

Pemetaan QTL yang paling banyak digunakan adalah intercross (F2) atau Backcross (BC) yang diproduksi dengan mengawinkan 2 inbred strains yang diketahui memiliki pembawa sifat yang berbeda. Hasil progenitor hybrid F1 juga dilakukan perkawinan antar F1 untuk menghasilkan generasi F2 atau BC ke salah satu orang tua untuk menghasilkan generasi BC. Pada setiap lokus, hewan F2 memiliki salah satu dari 3 genotip yaitu homozigot alell orang tua atau heterozigot, dengan satu allel dari masing-masing strain orang tua. Sedangkan hewan BC hanya memiliki dua kemungkinan genotip yaitu heterozigot atau homozigot. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

3. Consomic Lines  atau Chromosome Substitution Strains

Galur consomic atau strain substitusi kromosom (CSS) diproduksi dengan mentransfer kromosom tunggal dari strain donor kedalam strain resipien dengan BC berulang minimal sebanyak 10 generasi. Panel lengkap CSS terdiri atas 21 lines, 1 untuk 19 kromosom dan 2 kromosom sex. CSS lines merupakan populasi referensi genetik yang digunakan untuk lokalisasi QTL atau kelompok QTL terhadap sebuah kromosom tunggal dan memiliki beberapa keuntungan dibandingkan populasi pemetaan standard lainnya. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Pemetaan yang berhubungan dengan Haplotype (Haplotype Association Mapping /HAM)

Survei inbred strain merupakan langkah inisiasi penting dalam memahami struktur genetik dan fenotipik dari pembawa sifat yang kompleks. Pada tahun 2000, the Mouse Phenome Project telah dimulai sebagai upaya untuk mengumpulkan data fenotip dari set inbred strain. Data ini bersamaan dengan upaya untuk meningkatkan jumlah identifikasi SNPs pada tikus inbred dan membuat pemetaan SNP haplotype yang mirip dengan HapMap pada manusia. Pada tahun 2001, Grupe et al menggunakan fenotip inbred strain yang telah ada dari MPD dan lebih dari 3000 SNP telah diidentifikasi di laboratorium mereka, dan di institute Whithead telah dikembangkan “in silico QTL mapping” pada tikus. Haplotype association mapping (HAM) dapat digunakan sebagai alat untuk identifikasi QTL dengan syarat dapat menerapkan 3 faktor yaitu; melingkupi kepadatan SNP pada seluruh genom pada lebih banyak strain, data fenotip pada strain multiple dan dapat menganalisis asosiasi genotip-fenotip.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Mutagenesis

Langkah awal pada pendekatan forward genetic adalah dengan membuat lesi mutagenik yang dapat diturunkan, dan dapat diperiksa efeknya pada fenotip suatu organisme. (Lawson and Wolfe, 2011) Mutagenesis yaitu menginduksi mutase dengan bahan kimia atau radiasi, salah satunya dengan penggunaan N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sebagai mutagen kimia pada mencit yang telah dimulai sejak tahun 1978. ENU merupakan agen alkylating yang menyebabkan mutasi basa tunggal, biasanya transversi A-T menjadi T-A atau transisi A-T menjadi G-C. ENU menginduksi mutasi acak yang dapat diturunkan, dank arena alasan ini ENU dapat menginduksi mutase tunggal tanpa bias yang dapat mempengaruhi fenotip yang kompleks. Analisis selanjutnya setelah mutagenesis ini adalah pemetaan mutasi penyebab dan diikuti oleh identifikasi lesi genetik. (Tarantino and Eisener-dorman, 2012)

Gambar 3. 

Mutagenesis ENU. Skema standard mutagenesis ENU mencakup penyuntikan mencit jantan (G0) dengan ENU. Dosis bervariasi tergantun galur, tapi umumnya 3 kali seminggu injeksi 85-100mg/kg untuk mencit B6. Mencit jantan yang diinjeksi ENU menjadi infertile saat diterapi tapi kemudian banyak yang kembali subur setelah 10-12 minggu. Infertilitas sering digunakan sebagai indicator bahwa ENU bekerja efektif. Setelah kembali subur, mencit tersebut dikawinkan dengan betina normal dari galur yang sama ayau galur berbeda menghasilkan mencit G1, dan dapat diperiksa mutase dominan yang terjadi. Mencit G1 mendapatkan genom mutagenesis dari ayah dan mutase ini berbeda-beda diantara G1. Untuk recoveri mutase resesif, G1 betina dikawinkan dengan ayah G1 untuk menghasilkan G2. Dua cetakan mutase dari ayah dan anak betina akan ditemukan pada G3 dengan rata-rata 1 mutasi setiap 8 G3. Untuk alasan ini, pedigree G3 sering kali diperiksa fenotipnya untuk menemukan satu atau dua hewan yang terpengaruh dan membentuk koloni fenotip mutan baru.(Tarantino and Eisener-dorman, 2012). By dr. Sari Eka Pratiwi

DAFTAR PUSTAKA

Lawson, N.D., Wolfe, S.A., 2011. Perspective Forward and Reverse Genetic Approaches for the Analysis of Vertebrate Development in the Zebrafish. Dev. Cell 21, 48–64. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2011.06.007

Tarantino, L.M., Eisener-dorman, A.F., 2012. Forward Genetic Approaches to Understanding Complex Behaviors 25–58. https://doi.org/10.1007/7854

Zakhrabekova, S.M., Gough, S., Lundh, L., Hansson, M., 2013. Functional Genomics And Forward And Reverse Genetics Approaches For Identification Of Important QTLs In Plants 28, 23–28.

METODE TRANSFEKSI NON-VIRAL PADA SEL HEWAN DAN MANUSIA

By: dr. Sari Eka Pratiwi

Transfeksi adalah introduksi DNA asing kedalam nukleur sel eukariotik. Sel yang telah digabungkan dengan DNA asing disebut transfectants. Terdapat 2 penggolongan transfectants yaitu Stable transfectants (sel yang memiliki gabungan DNA asing pada genomnya) dan Transient transfectants (DNA asing tidak terintegrasi kedalam genom, namun gen tersebut diekspresikan pada waktu yang terbatas : 24-96 jam)(Ruedel and Bosserhoff, 2012)

Lebih dari 10 tahun terakhir tekhnik bioteknologi telah berkembang salah satunya untuk memasukkan makromolekul seperti DNA, RNA, oligonukleotida, protein dan molekul kecil ke sel eukariotik. Prosedur ini digunakan untuk mempelajari mekanisme ekspresi gen dan pengaturanyya, serta dalam pengembangan terapi gen untuk penyakit bawaan, kanker dan infeksi virus seperti AIDS. Ketika asam nukleat contohnya DNA yang mengkode protein ditransfer edalam nucleus sel target, maka DNA tersebut dapat digunakan sebagai cetakan sintesis mRNA yang dapat memproduksi protein terapeutik yang hilang maupun mengalami mutasi pada sel pasien.prinsip dasar transfer gen ini dapat diaplikasikan dalam praktek penelitian dengan mengkombinasi (atau memasukkan) sebuah gen bersama molekul pembawa (atau vector) yang dapat memfasilitasi DNA untuk dipindahkan secara aman dan efisien kedalam nucleus sel target. Teknik transfeksi yang umumnya digunakan dapat dibedakan menjadi 3 kelompok yaitu (1) metode yang menggunakan virus, (2) metode kimia dan (3) metode fisikal. (Lonza Cologne GmbH, 2012; Mitrović, 2003). Pada pembahasan berikut ini akan dibahas metode transfeksi non-viral pada sel hewan dan manusia

Agen transfer non-viral memiliki beberapa kelebihan dibandingkan virus rekombinan, salah satunya adalah tidak infeksius, relative non-imunogenik, memiliki toksisitas akut yang rendah, dapat mengakomodasi plasmid DNA berukuran besar dan dapat diproduksi secara sederhana pada skala besar. Namun kekurangannya adalah efisiensi transfer gen yang lebih rendah dibandingkan dengan mediasi virus, serta ekspresi gen yang sementara. (Mitrović, 2003; Tomizawa, 2013)

 

Gambar 1. Metode Transfeksi (Lonza Cologne GmbH, 2012)

 

1.      METODE FISIK

Metode transfeksi secara fisik dapat mentransfer langsung asam nukleat ke dalam sitoplasma atau nucleus tanpa menggunakan substansi asing seperti lipid(Lonza Cologne GmbH, 2012)

Gambar 2. Metode Fisik Transfer Gen(Das et al., 2015)

A. Electroporation / Electro-permeabilization

Elektroforasi merupakan metode transfer gen yang sering digunakan. Prinsip kerjanya adaah sebagai berikut: (Lonza Cologne GmbH, 2012)

Ø  Sel dan DNA disuspensi pada buffer elektroporasi

Ø  Arus listrik dengan tegangan tinggi dialirkan ke sel

Ø  Aliran listrik ini membentuk perbedaan potensial membrane dan muatan pada komponen membrane, hal ini menginduksi pori-pori pada membrane sel terbuka sementara dan DNA dapat memasuki sel.

Gambar 3. Metode electroporation (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

Metode ini dapat digunakan untuk mentransfer DNA dengan fragmen yang panjang dan efisiensinya pada cell lines cukup baik. Tidak seperti reagen liposomal, metode ini tidak menginduksi sitotoksisitas pada sel. Namun metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rendahnya efisiensi pada sel primer dan tingginya mortalitas dikarenakan tingginya arus listrik atau hanya sebagian perbaikan membrane yang terjadi dengan sempurna. (Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)

B.     Microinjection

Metode fisik ini terutama digunakan untuk manipulasi sel tunggal, seperti oosit dengan menginjeksi DNA, mRNA dan protein. Metode ini juga dapat digunakan untuk transfer DNA kedalam sel punca embrionik untuk membentuk organisme transgenic. Prinsip kerjanya adalah Menggunakan micromanipulator dan mikroskop, tipped pipet yang sangat halus diinsersikan kedalam sitoplasma atau secara langsung kedalam nucleus. (Lonza Cologne GmbH, 2012)

Keuntungan utama metode ini adalah efisiensi yang tinggi (mendekati 100%). Namun metode ini tidak cocok digunakan untuk transfeksi sejumlah besar sel dan metode ini memerlukan keahlian tertentu dari operator, membutuhkan waktu yang sangat lama dan biaya yang mahal.(Lonza Cologne GmbH, 2012)

Gambar 4. Metode mikroinjeksi(Ruedel and Bosserhoff, 2012)

C.     Biolistic Particle Delivery System

Metode ini telah sukses mentransfer asam nukleat kedalam sel kultur dan juga sel secara in vivo. Metode ini terutama digunakan untuk vaksinasi genetic dan aplikasi agricultural dimana sel permukaan pada seluruh organ dapat ditransfeksi. Prinsip kerja metode ini adalah sebagai berikut: (Lonza Cologne GmbH, 2012)

Ø  Transfer DNA yang telah dilapisi permukaannya menggunakan mikropartikel seperti emas atau tungsten

Ø  Partikel diakselerasi oleh particular driving force seperti dengan meningkatkan muatan bertegangan tinggi diantara 2 elektroda atau dengan tekanan gas

Tekhnik ini cepat dan sederhana, dan memungkinkan transfeksi pada sel yang sedang membelah maupun tidak membelah. Pada metode ini juga tidak terdapat batasan ukuran atau jumlah gen yang dapat ditransfeksikan. Namun mortalitas sel sangat tinggi, maka dari itu diperlukan jumlah sel yang besar pada metode ini.(Lonza Cologne GmbH, 2012)

Gambar 5. Metode Biolistic. Langkah 1: presipitasi DNA kedalam nanopartikel emas. Langkah 2: Masukkan campuran kedalam tabung. Langkah 3:putar tabung untuk menyelubungi DNA-gold ke seluruh permukaan. Langkah 4: cut tabung menjadi cartridge. Langkah 5:load cartridge ke dalam gene gun. Langkah 6: masukkan DNA ke dalam sel target (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

D.    Sonoporation

Frekuensi rendah iradiasi ultrasound menyebabkan gangguan mekanik pada membrane sel, sehingga memudahkan ambilan molekul besar disekitar gelembung kavitasi. Kolapsnya gelembung ini mengakibatkan terbentuknya lubang sementara pada membrane sel dan menginduksi permeabilisasi membrane yang bersifat sementara. Pembentukan porus kecil pada membrane sel oleh adanya gelombang ultrasound ini dapat mempermudah transfer DNA/RNA kedalam sel, teknik ini disebut dengan metode Sonoporation.(Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)

Sonoporasi ini memiliki beberapa kelemahan, diantaranya adalah rendahnya efisiensi transfer gen. untuk pengaplikasian sonoporasi secara in vivo pada seekor tikus diperlukan sekitar 37,5-50µg plasmid. Keterbatasan lainnya adalah kerusakan sel, akibat iradiasi sel dengan 2,25 MHz yang terus menerus selama 1 menit, terjadinya aktivitas enzimatik dan perubahan membrane mitokondria serta stress retikulum endoplasma dapat menginduksi apoptosis sel. (Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)

.

Gambar 6. Terbentuknya porus setelah paparan ultrasound(Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)

E.     Optical Transfection

Metode transfeksi optic merupakan metode yang menggunakan cahaya laser untuk secara sementara membuat sejumlah sel menjadi permeable dalam waktu yang sangat singkat. Beberapa substansi dapat diinjeksikan ke beberapa jenis sel dengan metode ini secara efisien, contohnya adalah ion, molekul keci, dextran, short interfering RNAs (siRNAs), plasmid, protein dan nanokristal semikonduktor. Keuntungan menggunakan system ini adalah metode ini sangat efisien dan bekerja pada banyak jenis sel, serta memerlukan manipulasi sel yang sangat sedikit. Kerugiannya adalah, metode ini memerlukan sel untuk ditempeli dan memerlukan peralatan yang mahal. (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

 

Gambar 7. Metode Optical Transfection (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

F.      Magnetofection

Metode transfeksi dengan mediasi magnet merupakan metode dengan menggunakan kekuatan magnet untuk menghantarkan DNA kedalam sel target. Asam nukleat pertama dicampurkan dengan nanopartikel magnetic, kemudian ditambahkan kekuatan magnet ke solusi kompleks asam nukleat-partikel menuju sel target dimana asam nukleat dilepaskan.(Ruedel and Bosserhoff, 2012)

 

Gambar 8. Metode Magnetofection. Langkah kerja : dilusikan asam nukleat didalam medium, tambahkan nanopartikel magnetic, kemudian inkubasi selama 10-20 menit. Tambahkan medium pada sel yang menempel (2-4x10⁵sel). Tambahkan larutan asam nukleat dan nanopartikel magnetic, kemudian tempatkan pada plate magnetic, inkubasi selama 15 menit. (Ruedel and Bosserhoff, 2012) 

Keuntungan menggunakan metode ini adalah pengerjaan yang cepat, peningkatan efisiensi transfeksi dengan transport langsung khususnya pada jumlah asam nukleat yang kecil, rata-rata transfeksi tinggi pada cell line mamalia adherent, dan membutuhkan perawatan sel yang minimal.(Ruedel and Bosserhoff, 2012)

2.      METODE KIMIA

Metode kimiawi merupakan teknik transfeksi menggunakan molekul pembawa untuk menembus barrier membrane sel, namun tidak terdapat reaksi kimia antara molekul pembawa dan asam nukleat maupun komponen selular lainnya. Prinsip metode ini adalah adanya interaksi asam nukleat dengan muatan negative dan molekul pembawa yang bermuatan positif., seperti polymer atau lipid, yang mempermudah asam nukleat untuk berkontak dengan komponen membrane yang bermuatan negative, dan kemudian menyatu kedalam sel melalui endositosis dan akhirnya dilepas ke dalam sitoplasma. (Lonza Cologne GmbH, 2012)

A.     DEAE-Dextran Transfection

Gambar 9. Struktur DEAE-dextran(Ruedel and Bosserhoff, 2012)

DEAE-dextran merupakan metode transfeksi non-virus pertama yang ditemukan oleh Vaheri dan Pagano pada tahun 1965. Prinsip metode ini adalah sebagai berikut :(Lonza Cologne GmbH, 2012; Mitrović, 2003)

Ø  DNA dicampurkan dengan DEAE- dextran, polybrene, polyethylenimine and dendrimer (polycationic turunan dextran, sebuah polimer karbohidrat) membentuk kompleks disebut polyplex

Ø  Kompleks DNA/polimer kemudian berkontak dengan membrane bermuatan negative dikarenakan muatan positif yang dibawa oleh polimer.

Ø  Kompleks DNA/polimer kemudian diendositosis

 

Gambar 10. Metode DEAE-Dextran. Solution A: DNA (~1–5 µg/ml) didilusi kedalam 2 ml  growth medium dengan serum mengandung  klorokuin. Solution B: larutan DEAE-dextran (~50–500 µg/ml). Solution C: Larutan ~5 ml of DMSO. Solution D: Complete growth medium. Langkah 1: campurkan Sol A dan B. Langkah 2:aspirasi medium sel kultur, kemudian tambahkan campuran Sol A dan B, inkubasi selama 4 jam. Langkah 3:aspirasi supernatant. Langkah 4: tambahkan solution C untuk induksi uptake DNA. Langkah 5: buang DMSO dang anti dengan Solution D, lakukan penilaian ekspresi gen . (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

 

Keuntungan menggunakan metode transfeksi DEAE-dextran adalah metode ini cukup sederhana dan murah. Namun efisiensi cukup rendah pada berbagai tipe sel, dan harus diperhatikan efek toksisitasnya. (Lonza Cologne GmbH, 2012)

B.     Calcium Phosphate Co-Precipitation

Metode transfeksi ini telah dilakukan oleh Graham dan Van pada tahun 1973. Prinsip pada metode ini adalah : (Lonza Cologne GmbH, 2012)

Ø  DNA dicampurkan dengan Calcium Chloride

Ø  Tambahkan buffer saline/larutan phosphate dan inkubasi pada suhu ruangan

Ø  Formasi DNA- calcium phosphate coprecipitates menempel pada permukaan sel kemudian diendositosis

Gambar 11. Metode Transfeksi dengan Calcium Phosphate. Solution A: DNA pada larutan Kalsium. Solution B: 2x Hanks buffered saline solution. Langkah 1:tambahkan Solution A dan B sambal di Vortex. Langakh 2: inkubasi 20-30 menit, tambahkan ke sel kultur. Langkah 3: inkubasi 2-12 jam, ganti solution  dengan complete growth medium. Langkah 4: penilaian transient dan stable transfectant. (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

 

Metode ini cukup luas digunakan karena komponennya mudah didapatkan. Selain itu keuntungannya adalah dapat diaplikasikan untuk transfeksi pada sel line, dapat digunakan untuk penelitian ekspresi gen dalam jangka waktu yang lama. Kelemahan dari metode ini mencakup toksisitasnya khususnya pada sel primer dan sensitivitasnya pada perubahan pH, suhu dan konsentrasi garam buffer, juga memiliki efisiensi yang rendah jika dibandingkan dengan metode kimiawi lainnya seperti lipofection. (Lonza Cologne GmbH, 2012)

C.     Liposome Encapsulation (Lipofection)

Lipofection merupakan metode transfer gen yang umum digunakan. Terdapat 3 generasi diantara reagen lipofection, generasi pertama yaitu reagen liposomal kationik yang terdiri dari muatan positif seperti amine, ester atau ether dan grup 2 atau lebih . Generasi kedua yaitu reagen liposomal multikomponen yang terdiri dari lipid, polimer dan kombinasinya. Dan generasi ketiga terdiri dari reagen liposomal multikomponen yang berkonjugasi dengan antibody atau ligand yang memiliki target spesifik. (Lonza Cologne GmbH, 2012)

Prinsip kerja metode ini yaitu :(Lonza Cologne GmbH, 2012; Ruedel and Bosserhoff, 2012)

Ø  Lipid kationik dicampur dengan lipid netral/ helper lipid (contohnya DOPE), terbentuk unilamelar vesikel liposom yang membawa muatan positif

Ø  Asam nukleat diserap kedalam vesikel ini

Ø  Absorbs ionic ke membrane selular

Ø  Uptake struktur ini secara endositosis

Ø  Helper lipid seperti DOPE membantu DNA lolos dari endosome dengan adanya fusi liposom dan membrane

Gambar 12. Metode Transfeksi : Liposomal/lipofection (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

Keuntungan utama dari reagen transfeksi lipid ini adalah kemampuannya untuk mentransfeksi pada banyak variasi tipe sel (terutama adherent cell line ) dengan efisiensi tinggi serta harga yang cukup murah. Keuntungan lainnya adalah dapat membawa DNA dalam berbagai ukuran, RNA dan protein baik untuk transient maupun untuk produksi protein. Namun terdapat beberapa kekurangan pula pada metode ini, seperti rendahnya efisiensi pada sebagian besar cell line yang berbentuk suspense, yang dihubungkan dengan aktivitas endositosisnya, toksisitas dan terkait pada pembelahan sel.(Lonza Cologne GmbH, 2012; Tomizawa, 2013)

Generasi kedua menggunakan lipid non-liposomal dan polymer yang bergabung bersama DNA atau RNA dan membentuk mecelles. Reaksi ini seringkali dilakukan dalam kondisi aqueous. Dendrimers merupakan makromolekul globular 3 Dimensi yang mampu memadatkan DNA dalam kompleks kecil, dan meningkatkan efisiensi transfeksi plasmid. Dendrimers stabil pada aserum dan tidak sensitive terhadap suhu, sehingga memiliki efisiensi transfeksi yang tinggi pada beberapa model kultur jaringan. Namun begitu, dendrimer juga non-biodegradable dan dapat menyebabkan sitotoksisitas yang signifikan. (Lonza Cologne GmbH, 2012)

Gambar 13. Overview metode lipofection (Ruedel and Bosserhoff, 2012)

DAFTAR PUSTAKA

Das, A.K., Gupta, P., Chakraborty, D., 2015. Physical methods of gene transfer: Kinetics of gene delivery into cells: A Review. Agric. Rev. 36, 61. https://doi.org/10.5958/0976-0741.2015.00007.0

Lonza Cologne GmbH, 2012. An Introduction to Transfection Methods. Infection 49, 395–401. https://doi.org/10.3791/5068

Mitrović, T., 2003. Gene Transfer Systems. Med. Biol. 10, 101–105.

Ruedel, A., Bosserhoff, A.K., 2012. Transfection Methods. Methods Cell Biol. 112, 163–182. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405914-6.00008-1

Tomizawa, M., 2013. Sonoporation: Gene transfer using ultrasound. World J. Methodol. 3, 39. https://doi.org/10.5662/wjm.v3.i4.39