Analisis Northern blotting merupakan sebuah metode untuk memperoleh informasi mengenai ukuran dan kelimpahan RNA spesifik didalam sebuah campuran. Singkatnya, sampel RNA (contoh: keseluruhan RNA sel atau sabuah fraksi) di fraksinasi dengan elektroforesis gel. Kemudian RNA ditransfer kedalam membrane (blotted) dan dianalisis dengan pengikatan (hybridization) satu atau lebih prode spesifik yang telah dilabel untuk RNA yang ingin ditemukan. Northern blotting merupakan pengembangan dari teknik yang serupa untuk analisis DNA, yaitu Southern blotting, yang dikembangkan oleh Ed Southern.(1)
Analisis Northern blotting memberikan informasi mengenai panjang molekul RNA dan kemungkinan keberadaan variasi panjang RNA, karena RNA dielektroforesis dibawah kondisi denaturasi dan disejajarkan dengan penanda amolekular (RNA ladder). Molekul RNA yang bercabang atau sirkular memiliki mobilitas yang berbeda dan analisisnya memerlukan prosedur khusus. Northern blotting sering digunakan untuk memperlihatkan keberadaan RNA spesifik didalam sebuah sampel, namun metode ini juga dapat digunakan untuk pengukuran kuantitatif. RNA yang stabil menunjukkan jumlah produksi dan penghapusan RNA, hal inilah yang diukur.(1)
Analisis Northern blotting mRNA merupakan pemeriksaan yang sangat sensitive terhadap adanya degradasi ringan dari sampel. Karena alasan ini, sangat penting untuk pemeriksaan RNA secara visual setelah elektroforesis gel. RNA dapat dengan mudah diwarnai dengan Etidium Bromida sama seperti DNA, walaupun kurang efisien karena pengikatan oleh interaksi ionik bukan interkalasi. Salah satu pendekatan adalah dengan menambahkan etidium bromide kedalam loading buffer untuk gel formaldehid. Hal ini memudahkan pemeriksaan selama gel bekerja. Namun hal ini tidak dapat dilakukan pada gel glyozal, karena etidium bromide dapat berinteraksi dengan gel glyoxal dan mempengaruhi kemampuannya untuk mendenaturasi RNA. Sebagai alternatif, gel diwarnai setelah running.(1)
Terdapat dua pendekatan langkah blotting dari analisis northern blotting, yaitu capillary blotting dan electroblotting. Metode tradisional dengan transfer kapiler secara pasif (mirip dengan metode Southern blotting klasik) dapat dilakukan dengan bahan yang umumnya terdapat di laboratorium. Esensinya, tumpukan kertas atau bahan absorbent yang sama digunakan untuk menarik buffer transfer tinggi garam dari wadah, melalui gel dan sebuah membran pengikat RNA ditempatkan diatas gel. Proses transfer memerlukan beberapa jam dan biasanya dapat berlangsung sepanjang malm. Transfer kapiler merupakan pilihan metode untuk gel agarose, sementara electroblotting digunakan untuk gel poliakrilamid. Pada metode ini, gel dan membrane ditempatkan pada kaset special didalan sel elektroforesis. Sebuah bidang elektrik diterapkan tegak lurus pada kaset, dan RNA ditransfer ke membran. Electroblotting dapat berlangsung kurang dalam 1 jam pada sebagian besar kasus.(1)
Pemilihan membran filter merupakan hal yang sangat penting dalam analisis northern blotting. Terdapat beberapa pilihan berbeda, tetapi untuk hamper semua tujuan, membran nylon dengan beban positif adalah yang paling optimal. Beban positif dikarenakan kelompok amino pada permukaan membran dan memiliki efek rangkap dalam meningkatkan afinitas asam nukleat dan memfasilitasi imobilisasi RNA pada membran. Membran nylon dicirikan dengan kekuatan regang yang tinggi dan kapasitas pengikatan yang tinggi (4-500µg/cm2). Nylon diproduksi dengan ukuran pori yang berbeda (0,22 dan 0,45 µm) dan beberapa dioptimalisasi, contohnya untuk mengikat RNA yang berukuran kecil. Jika gel diwarnai dengan etidium bromide, keberhasilan transfer dapat dikonfirmasi dengan inspeksi filter dengan sinar UV. Hal ini juga memungkinkan inspeksi gel untuk memastikan bahwa transfer telah selesai dan tidak terdapat bias akibat adanya transfer dari small RNA.(1)
Gambar 1. Langkah analisis Northern blotting (1)
Prosedur analisis selanjutnya adalah hibridisasi, hal ini dengan menambahkan probe ke membran pada kondisi yang mendukung penempelan spesifik yang komplementer pada molekul target di membran. Probe yang ditambahkan penanda untuk mempermudah deteksi pengikatan label pada targetnya. Pendekatan yang paling banyak digunakan adalah dengan menggunakan penanda radioaktif (32P), namun terdapat juga alternatif non-isotop. Probe non-isotop ini umumnya kurang sensitif daripada probe yang dilabel dengan 32P.(1)
Analisis Northern blotting bukan hanya merupakan teknik yang menunjukkan keberadaan dan kuantitatif dari jumlah RNA spesifik. Pada penelitian proteksi nuclease, rantai probe yang dilabel dihibridisasi ke sampel RNA. Kemudian, rantai tunggal yang tidak dihibridisasi dihilangkan oleh degradasi nuclease dan hybrid dianalisis pada gel. Teknik ini lebih sensitif (batas deteksi 0,1-1pg) disbanding analisis Northern blotting klasik (batas deteksi 1-10pg) dan lebih reliabel karena langkah hibridisasi terjadi pada solution.
Gambar
2.
Tiga langkah blotting berbeda pada analisis northern
blotting. A. Upward capillary
transfer, menggunakan gel agarose dan memerlukan waktu yang lama dari
beberapa jam hingga 1 malam. B Downward
capillary transfer, menggunalan gel agarose dan selesai dalam waktu 1 jam
namun dapat juga selesai dalam beberapa jam. C. Electroblotting, menggunakan gel poliakrilamid dan jarang
menggunakan gel agarose. Waktu yang diperlukan tergantung dengan tipe gel, tapi
biasanya selesai dalam 1 jam. D. pada semua tipe transder pada gel dibatasi
dengan overlapping strips dari
parafilm untuk menghindari sirkit pendek.(1)
Daftar Pustaka
1.
Frohman MA. On beyond classic RACE
(Rapid amplification of cDNA ends). Genome Res. 1993;4(1):87–105.
2.
Bee MA. NIH Public Access.
2009;75(5):1781–91.
